臭氧去除食品加工设备中的荧光假单胞菌生物膜的研究

食品加工环境和设备内生物膜的形成增加了产品变质和病原体污染的风险。就地清洗(CIP)操作在去除土壤和消毒处理设备(包括消除生物膜)方面非常有用。然而，CIP是一个资源密集型的过程，特别是在化学洗涤剂，热和消毒剂的使用方面。本研究旨在探讨将臭氧整合到CIP操作中的可行性，以促进假单胞菌生物膜的消除，其长期目标是减少对传统清洁和消毒试剂的依赖。为了研究臭氧与CIP的结合，在一个中试食品加工设备上，在10%脱脂牛奶(脱脂牛奶-水混合物，1:9 v/v)中培养2天，在静止条件下培养出荧光假单胞菌，然后在添加10%新鲜脱脂牛奶的情况下再循环5天。CIP采用22-25℃水洗，50℃0.2%氢氧化钾碱性清洗，很后用水冲洗。这些CIP操作将浮游细胞数量减少到低于检测方法的极限，但并没有从加工设备的光滑或粗糙表面完全去除荧光假单胞菌生物膜。当CIP过程之后应用含水臭氧步骤(10 ppm, 10分钟)时，处理减少了光滑和粗糙表面的生物膜细胞数量，低于回收方法的检测限(分别为0.9和1.4 log CFU/ 100 cm2)。这些结果证明了臭氧辅助CIP在去除加工设备上的微生物生物膜方面的效用，但需要进一步研究以优化清洗剂的使用和臭氧的应用。

1. 介绍

在食品加工环境中，对致病菌(如假单胞菌和单核增生李斯特菌)的控制一直是一个难点。在适当的水分和营养条件下，这些细菌可以在食品加工设备上快速形成生物膜(Brooks and Flint, 2008)。由此产生的生物膜是食品重复污染的持续来源，这在很大程度上影响了产品的保质期和安全性。事实上，生物膜在食品行业，特别是乳制品行业中的作用已经得到了广泛的研究(Panebianco等人，2022)，研究人员发现，细菌可以在乳制品加工操作的几个环节和加工设备的许多部分形成生物膜(Marchand等人，2012)。变质微生物如假单胞菌的生物膜被认为是乳品加工操作中的一个具有挑战性的问题。假单胞菌属的成员无处不在，经常从乳制品生产设备或乳制品中分离出来。假单胞菌产生耐热脂肪酶和蛋白酶，这些酶在牛奶热处理后会持续存在，从而通过产生不良风味和气味导致很终产品变质(Zhang等人，2019)(Reichler等人，2021)。几种假单胞菌通常从乳制品工厂分离出来;其中包括荧光假单胞菌、fragi假单胞菌、恶臭假单胞菌、嗜虫假单胞菌和铜绿假单胞菌(Chiesa et al.， 2014)。

就地清洗(CIP)操作旨在通过尽量减少加工过程中的产品再污染来确保加工食品的安全(Seiberling, 1997)。CIP系统去除设备内部表面沉积的材料，无需打开或拆卸设备，很少或根本不需要人工操作(Smithers, 2022)。传统的CIP操作在去除食品接触面上形成的生物膜的效果上各不相同(Dufour等，2004)。这种操作通常由以下步骤组成:(1)用水冲洗;(2)碱清洗，或不加酸洗;(3)卫生处理。消毒步骤的设计是为了保持设备足够的卫生条件。这一步骤通常涉及使用杀菌剂，包括氯、过氧乙酸、碘剂或季铵化合物(Joseph et al.， 2001)。然而，处于生物膜状态的细菌可以对这些杀菌剂的抗菌作用产生保护作用(Srey et al.， 2013;Wassenaar et al.， 2015)。大量使用这些杀菌剂可能会对人类健康产生负面影响，并导致加工设备恶化(Marino et al.， 2018)。作为一种替代消毒剂，臭氧在食品工业中已被广泛应用，并被批准用于食品处理、储存和加工(食品和药物管理局，2001年)。臭氧的特点是对许多致病性和腐败微生物具有很强的抗菌活性，并因其对环境的影响很小而被认为是一种环保消毒剂(Pascual等人，2007;Marino et al.， 2018;Masotti等人，2019;Bigi et al.， 2021)。臭氧通过多种机制破坏微生物的细胞质膜和其他细胞成分，包括氧化不饱和脂质、蛋白质和核酸，从而使微生物失活(Khadre et al.， 2001)。臭氧还可以阻止微生物细胞与表面的初始附着，并通过破坏参与细胞的细胞外基质来抑制生物膜的形成(Panebianco et al.， 2022)。

假单胞菌在加工环境中形成生物膜是食品工业中一个相当大的问题，它可能导致产品变质和疾病爆发(Srey等人，2013)。关于假单胞菌生物膜在工业环境下的生成和臭氧对这种生物膜的使用的系统研究是缺乏的。因此，本研究的目的是:(1)研究当脱脂牛奶(乳制品的一个例子)作为营养来源时，荧光杆菌在中试规模的食品加工设备上形成坚固的生物膜的能力;(2)评估在CIP净化过程中使用臭氧作为消毒剂的生物膜控制技术的效果。

2. 材料与方法

2.1. 臭氧辅助就地清洗系统

臭氧辅助CIP系统(图1)是俄亥俄州立大学的研究人员和一家臭氧设备制造商(Del ozone, San Luis Obispo, CA)合作为本研究定制的。该系统(图1)由一个132升的容器(用于存放漂洗水)，三个57升的容器(用于存放碱性溶液，酸性溶液和消毒剂)，一个热交换器(型号:STFT-6000-240;TruHeat, Richmond Hill, ON, Canada)，一个泵，以及测量湍流，温度，pH值和电导率的仪表。离心泵(Gould离心泵，型号NPE 1ST1F5B6, Seneca Falls, NY)用于将CIP流体循环到中试规模的食品加工设备，并由GS AC Drive (Automation Direct, Cumming, GA)调节。监测和数据采集使用两个流量计(Blue-White Industries F-1000, Huntington Beach, CA)，两个热电偶(Omega, Stamford, CT)，一个pH计(Jenco Instr。(Emerson/Rosemount Analytical Model 1056 Dual Input Analyzer, Shakopee, MN)，两个电导率探头(Emerson)。这些探头被放置在CIP系统的入口和返回线中，与加工设备相关。CIP设备的设置方式是，通过打开适当的阀门，CIP泵可以从任何单个容器(水，碱性，酸性或消毒剂)中抽出流体，并通过喷雾球将流体引导到加工设备;然后，水流将流经所有的加工生产线，并将水返回到启动水箱，或者简单地通过加热器将水再循环并返回到水箱以控制温度。臭氧卫生系统(Del ozone AGW 4045)具有内置臭氧发生器和控制器(Del ozone Genesis CD-45GV)，与CIP系统集成在一起。滑板的臭氧部分有自己的循环回路，带有第二个泵(型号:NPE 1ST1F1B4，古尔德泵)，在使用过程中不断产生和维持臭氧化水。臭氧系统的设置使CIP泵可以从主臭氧水罐中抽取水。

图1.代表与臭氧发生器集成并结合中试规模食品加工设备的中试规模原位清洗系统。

2.2. 中试食品加工设备

CIP系统连接到模拟食品加工设备的中试装置上，该设备由304级不锈钢制成(图2)。加工设备的构造便于在清洗过程中连接到CIP系统。加工设备包括:(a) 190-L的罐(容器)，(b)放置在较大管道内的填料阀，(c)管三通，(d)旁通管线，(e)四个小管段(内径2.54 cm，长5.08 cm，内表面积40.5 cm2)，使用粗砂碳化硅球筒磨具(Brush Research manufacturing, CA)人工制造表面粗糙的管段，(f)四个90°弯头(内径2.54 cm，内表面积117.0 cm2)，表面光滑，(g)回流泵(古尔德泵)，型号NPE 1ST1C5E6)，和(h) 7.6米(25英尺)的2.54厘米直径管。

图2.实验装置的表示，包括用于污染中试规模加工设备和在不锈钢表面上开发乳品生物膜的结垢系统。污垢设备由以下部分组成，如图所示：（1）19-L高密度聚乙烯容器，（2）带4.8毫米穿孔的内部过滤器，（3）在线路上的三个外部过滤器，网孔尺寸为20，40和40，（4）循环蠕动泵，（5）进料管路蠕动泵，（6）5-L进料瓶， （7）插入氯丁橡胶管的小不锈钢管。加工设备的组成包括：不锈钢T型管（8），旁通阀（9），填料（10），旁通管（11），四个粗糙表面管段（12）和四个光滑表面90°弯头（13）。

2.3. 污染系统

所需的实验生物膜需要是坚固的，并模拟当食品加工设备的清洁被忽视或效率低下时自然会发生的情况。为了使研究易于管理和实验可重复，生物膜在7天的过程中生成。为了生成这种生物膜，研究人员开发了一种污染系统，该系统由一个19-L高密度聚乙烯容器组成，该容器可容纳7.6 L接种的生长培养基，然后在系统中缓慢循环。该设备有一个四步过滤系统，可以在流体流到达泵之前将较大的颗粒从流体流中去除。第一个过滤器作为吸力过滤器放置在容器内(4.8 mm穿孔;麦克马斯特-卡尔，哥伦布市，俄亥俄州)。其他三种过滤器(滤网尺寸分别为20、40、40;麦克马斯特-卡尔)是外部的容器，设计用于在污染运行过程中拆卸和清洁，而无需拆卸整个系统或排水。通过过滤器后，流体进入蠕动泵(Masterflex型号:7553-70;Masterflex头型号:7015;Barrington, IL)，它被指定为“循环泵”，通过目标处理设备部件传输污染流体(图2)。第二个5-L储液器包含灭菌介质，连接到第二个蠕动泵(Masterflex型号:7521-50;机头型号:7016;Masterflex)被绑在污染系统的输入线上，慢慢地添加新鲜培养基，以保持生物体在多天的孵化中生长。污垢系统包含多个小的不锈钢管(每根内径为6.35 mm，长9.05 mm，内表面积为3.78 cm2)插入壬二烯管(06402-15;科尔·帕默，弗农山庄，伊利诺伊州);这些试管用于检测荧光假单胞菌污染期间生物膜形成的稳健性。

2.4. 荧光假单胞菌培养物的制备

荧光假单胞菌ATCC 25289来自俄亥俄州立大学(Columbus, OH)微生物系的培养标本。将细菌的冷冻培养基传代于胰酶豆汤(TSB;Becton Dickinson & Co.， Sparks, MD)，并在摇床培养箱(New Brunswick Scientific Co. Edison, NJ)中轻度搅拌，在30°C下孵育48小时。将荧光假单胞菌培养物铺在胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)上;Becton Dickinson & Co.)，在环境温度(22-25°C)下孵育48小时，然后在TSB中传代，然后用于实验(Meyer和Abdallah, 1978)。

2.5. 荧光假单胞菌生物膜发育

为了诱导生物膜的形成，在7.6 l容量的污染系统中进行如下操作。脱脂牛奶(Kroger Co.， Cincinnati, OH)， 760 mL，用蒸馏水稀释至总积7.6 L，然后在121°C高压灭菌30分钟;这将被称为“生物膜培养基”。生物膜培养基冷却至室温(22-25℃)后，接种38 mL (0.5% v/v) P. fluorescens ATCC 25289培养物。接种的生物膜培养基在循环中循环30 min，停滞2 d，然后以1.5 ~ 2.0 L/h的速度恢复循环5 d。接种后的培养基在主污染回路循环的同时，在5-L瓶中填充新鲜的生物膜培养基，用第二蠕动泵以125 mL/h的速度泵送内容物，为荧光假单胞菌继续生长添加新的营养物质(图2)。

在生物膜发育过程中，生物膜样品(即污染回路不锈钢管)在以下时间点取出:循环开始前(即2天停滞孵化后)和循环5天期间每天取出。每个生物膜样品由2管组成，一管用于荧光假单胞菌计数，另一管用于扫描电镜检查。

2.6. 使用臭氧辅助CIP去除食品加工设备中的荧光假单胞菌生物膜

在进行实验之前，用洗涤剂溶液清洗所有加工设备的元件并漂洗。除产品罐外，这些元件在121°C下高压灭菌30分钟。在实施CIP之前，为了在设备上形成生物膜，在罐和出口管道之间添加污染液，并允许流过填料、旁路、5.08厘米的小管段和弯头，然后返回污染回路。初步试验表明，该加工槽易于清洗，因此，该加工槽出口管道是研究的主要对象。因此，受污染的部件为t形管(8)、旁通阀(9)、填料(10)、旁通管线(11)、4个表面粗糙的小管段(12)和4个表面光滑的90°弯头(13)。接种后的生物膜培养基先在循环中循环30分钟，停滞2天，然后恢复循环5天，如上所述。在形成坚固的荧光假单胞菌生物膜后，CIP工艺按以下步骤依次实施:(1)预漂洗，(2)漂洗后的碱性清洗，(3)臭氧消毒。管段(图2，组件12)和弯头(图2，组件13)是用来评估CIP步骤去除荧光假单胞菌生物膜有效性的部分。每个CIP步骤后，去除一个节段和肘部，替换新鲜无菌部分，并擦拭其内表面以评估生物膜去除情况。

2.6.1. 除去

一旦生物膜形成过程完成，被污染的处理设备连接到CIP系统，随后去除污染系统。采用过滤35 μm的自来水，在22-25℃温度下进行预升。冲洗水由水箱经CIP进口泵以56.7 L/min的速度单次输送，保证湍流流动;流体的流速为1.87 m/s。冲洗时间确定为1 min，以确保去除所有乳土。

2.6.2. 碱性的清洁

用水预漂洗后，将过滤35 μm的自来水与碱性洗涤剂(CIP 100;Steris, Mentor, OH)，达到0.2%的浓度。通过在线加热器循环，将溶液加热至50°C。温度由温度控制器(欧姆龙E5C2, Allied Electronics & Automation, Worthington, OH)管理。待温度稳定后，向加工设备内充入碱性溶液，以56.7 L/min的速度循环2 min。清洗过程中控制温度(50±2℃)和流速(1.87 m/s)。

2.6.3. Post-rinse

后冲洗消除了被清洗系统中的碱痕迹，并冷却了系统，使其为臭氧消毒做好准备。经过35 μm过滤的自来水从用于水预冲洗的水箱中取出。将漂洗水引入系统，并测定了溶液在进出口线的电导率。当水电导率达到所需值(22-25℃下300-320 μsc)时，再继续冲洗1分钟，直至冲洗完毕并关闭水泵。水流稳定在56.7 L/min。

2.6.4. 臭氧卫生处理

在环境温度(22-25°C)下使用臭氧水溶液作为消毒剂。空气作为臭氧发生器的入口气体，因为它有一个集成的氧气浓缩系统。用电晕放电法将浓氧转化为臭氧，并借助文丘里装置与水混合。将臭氧水溶液储存在臭氧-水箱中(图1)，通过离心泵(古尔兹泵型号:NPE 1ST1F1B4)在文丘里腔内循环，直至达到所需浓度。过量的臭氧由热催化臭氧破坏装置(Del ozone)去除。在该研究中测试了5 ppm或10 ppm的含水臭氧。低浓度(5ppm)应用5min, 10ppm的臭氧溶液测试10min。溶液中臭氧浓度由臭氧监测仪(Q450;ATI，学院维尔，宾夕法尼亚州)在进口和出口线。此外，通过分光光度计(Spectronic 1201, Milton Roy Co.， Houston, TX)在258 nm (A258)处测量紫外吸收，采用紫外光谱法确定了水溶液中臭氧的浓度。

2.6.5. 臭氧辅助CIP系统的抗菌膜效果

改进的CIP系统对未附着的(浮游)和附着的(生物膜)荧光假单胞菌细胞群的有效性进行了评估。浮游细胞的样本从CIP回路回路上的隔膜取样口采集(图1)。这些样本在清洗过程开始前，在预漂洗、后漂洗碱性清洗和臭氧消毒后，使用10cc注射器(Becton, Dickinson & Co.)采集。在0.1%蛋白胨水中进行连续稀释，并使用灌注镀技术将1ml等分液与熔融TSA (Becton Dickinson & Co.)混合(Yousef et al.， 2022)。30℃孵育48 h，计数菌落。第二种类型的采样是为了推断清洁过程对生物膜细胞的有效性。生物膜样品取自粗糙和光滑表面;这些分别是不锈钢节段(图2，组件12)和弯头(图2，组件13)。为了评估CIP对荧光假单胞菌生物膜种群的影响，在整个清洗过程开始前，在预漂洗、后漂洗碱性清洗和臭氧消毒后，分别去除一段和一个肘部。将切除的切片替换为无菌切片，并恢复清洗过程。

2.7. 生物膜的枚举

为了确定污染装置形成的生物膜，在5天的生物膜介质循环中，每天从污染回路(图2，组件7)中取出两根小不锈钢管，以监测强健生物膜的发展。将每个不锈钢管无菌放入含有25 mL 0.1%蛋白胨水的50 mL螺旋盖小瓶中。手动摇瓶，然后用另外10ml 0.1%蛋白胨水冲洗试管，以去除未附着的细胞。用两根无菌棉签拭除管内表面的生物膜细胞，将棉签尖端断开，放入含有9ml 0.1%蛋白胨水的玻璃管中。管，包括拭子，在旋涡混合器(Fisher Scientific Industries, Inc.， Bohemia, NY)中混合约30秒。将得到的悬浮液用0.1%蛋白胨水稀释，用倒镀法将其镀在TSA上，并在30°C下孵育2天(Yousef et al.， 2022)。每管平均CFU换算为CFU/ cm2。

为了在臭氧辅助CIP过程中对荧光p.h ncens生物膜进行计数，用三根无菌棉签(Fisher Scientific)擦拭不锈钢节段和肘部的内表面，将生物膜细胞从棉签的尖端分离到含有25 mL 0.1%蛋白胨水的管中。包括拭子在内的试管在旋涡混合器中混合约30秒。将得到的悬浮液用0.1%蛋白胨水稀释后，用倒镀法镀在TSA上，在30℃下孵育2天。每节平均CFU数换算为CFU/100 cm2。

2.8. 扫描电子显微镜对生物膜的检查

为了用扫描电镜检查小不锈钢管内的生物膜，需要一些准备;这些准备工作按照之前的描述进行(Speers等人，1984;Latorre et al.， 2010)，并做了一些修改。从污染系统中取出的试管，用10ml 0.1%蛋白胨水冲洗，然后放入玻璃小瓶中。用2.5%戊二醛固定于0.1 M磷酸缓冲液中，pH为7.4的葡萄糖溶液中。试管在0.1 M磷酸盐缓冲液中冲洗3次，每次15分钟，然后将每个试管小心地纵向切成两半。半管片在0.1 M磷酸盐缓冲液中冲洗三次，每次冲洗15分钟。将洗涤后的含生物膜的半管分别在增加浓度的乙醇(25、50、70、85和95%)中脱水10分钟，然后在100%乙醇中脱水3次，每次30分钟。将干燥的样品安装在铝桩上，并在溅射涂层机(Cressington, Redding, CA)中用金涂层2分钟。对样品进行扫描电镜成像(Nova 400 NanoSEM, FEI, Hillsboro, OR)。

2.9. 统计分析

实验至少重复进行，并独立重复两次。数据用两个独立重复的平均值±SD表示，使用统计软件(GraphPad Prism 9.0.0;GraphPad软件公司，圣地亚哥，加州)。采用方差分析(ANOVA)，采用Tukey两两比较，确定治疗组之间或治疗对比较的显著性差异。p≤0.05认为差异有统计学意义。

3.结论

在中试规模的食品加工设备上开发坚固的生物膜具有挑战性;然而，克服这一限制使我们能够验证臭氧辅助CIP是消除荧光假单胞菌生物膜的有效方法。本研究提供的证据表明，标准的就地清洗制度使荧光假单胞菌浮游细胞低于计数法的检出限;然而，完全消除生物膜细胞是不可能的。在清洁过程中加入臭氧作为消毒剂，可以完全去除加工设备粗糙或光滑表面上的生物膜细胞。目前的研究表明，臭氧辅助CIP可以成为食品加工商净化加工设备的有效方法，特别是在乳制品行业。