臭氧对营养菌和孢子菌的灭活作用研究

不同类型微生物的气态臭氧灭活是成功地实现的，众所周知，只要气相被强烈加湿。然而，这一过程中涉及的失活机制和物种尚未明确确定。为了深入了解，我们考虑将细菌孢子暴露在干燥而不是潮湿的臭氧中，这是一种不太复杂的化学环境。与大多数已发表的文献相反，研究表明，在严格的干燥臭氧条件下，细菌孢子可以灭活，但灭活程度在很大程度上取决于孢子类型和底物材料。在这种情况下，由于没有检测到孢子的外部侵蚀，因此确定O3分子通过其扩散到孢子内并在孢子内氧化作用来负责失活过程。

使用加湿臭氧，观察到较高的失活效率，这很可能部分与孢子的膨胀ling有关，这有助于氧化物质在其内部扩散并一直扩散到核心;除O3外，这些氧化剂源于O3与H2O的相互作用，很终导致孢子结构严重受损，而与干臭氧暴露相比，孢子完整性得以保持。

以往工作回顾

从一开始以及此后相当长的一段时间内，在环境空气中使用臭氧作为气态杀菌剂的浓度水平被限制在接近1ppm的水平(事实上，就人体毒性而言，0.1 ppm被确定为占用(每周40小时)很大安全值)。

Elford和Van de Eude(1942)在已知温度和相对湿度(RH)值的房间中对气溶胶化细菌悬浮液进行了研究，他们确定在60-80% RH的房间中，臭氧浓度超过1ppm是相对于干燥环境的更好条件。

Kowalski等人(1998)研究了空气中高浓度臭氧对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌营养细菌的影响。

将微生物暴露于空气中浓度为300至1500 ppm、相对湿度为18-20%的臭氧中10至480秒:在1500 ppm和8分钟内，两种微生物的死亡率均超过99.99% (>4 log)。

依靠干气体臭氧，但浓度要高得多，Held研究了医院废物的净化(Held, 2002;Coronel等人，2002年)，由革兰氏阳性和革兰氏阴性的营养细菌、真菌、分枝杆菌和孢子细菌(如萎缩芽孢杆菌、嗜脂嗜热地杆菌和产气荚膜梭菌)组成。测试了从干空气电晕放电中获得的臭氧浓度为10,000-12,000 ppm。

该系统允许超过107个营养细菌/mL的失活(金黄色葡萄球菌，萎缩杆菌，大肠杆菌…)

暴露1小时内，处理2小时后孢子数超过107个/mL。

Ishizaki等人(1986)研究了臭氧浓度在250至1500 ppm(0.5至3 mg/L)范围内的气态臭氧对不同芽孢杆菌孢子的杀孢活性，并着重研究了相对湿度水平的影响。

在50%或更低的相对湿度下，暴露6小时后，存活的数量没有明显减少。

然而，在较高的RH值下，在不到2小时的时间内达到了5对数的降低，这一点后来被Currier等人(2001)证实。

Aydogan和Gurol(2006)的结果还表明，在70-95%相对湿度的条件下，将O3浓度从1 mg/L增加到3 mg/L，可以提高孢子的失活率，但超过3 mg/L (1500 ppm)时，只观察到微弱的额外增加。

从前面的作品中可以看出三点:

(i)臭氧浓度越高，相对湿度越高(0.50%)，灭活过程越有效。

事实上，在某些情况下，湿度是绝对需要的，以达到无菌，如TSO3的情况

TM灭菌系统，由加拿大卫生部和FDA(美国食品药品管理局)批准;

(ii)加湿的气态臭氧相对于干的气态臭氧作为杀生剂的附加值肯定是在干臭氧条件下几乎没有工作的部分原因(Ishizaki et al.， 1986);

(iii)然而，根据文献尚未严格确定臭氧过程中涉及的失活机制和物种。

臭氧暴露下可能的失活机制综述

强氧化剂通常能够化学攻击微生物的成分，即蛋白质、不饱和脂质、革兰氏阴性细菌的脂多糖层、细胞内酶(如呼吸酶)和核酸(遗传物质)，以及孢子外壳和病毒衣壳中的蛋白质和肽聚糖(Tseng和Li, 2008)。

营养细菌

臭氧使营养细菌失活是一个复杂的过程，因为臭氧会破坏营养细菌的大量成分;然而，O3被认为主要引起细菌细胞壁和细胞质膜上的蛋白质和脂质氧化。这些结构的逐渐降解涉及到渗透性和细胞完整性的改变，并且通常伴随着细胞裂解(Broadwater et al.， 1973;Kim and Yousef, 2000;Khadre and Yousef, 2001;Thanomsub et al.， 2002)。

沿着这条线，Kim和Youssef(2000)观察到革兰氏阴性菌(大肠杆菌…)的损害更为明显。可能是因为它们的脂多糖层比革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌…)(Komanapali and Lau, 1998;Komanapali and Lau, 1996)。Hunt和Marinas(1999)基于透射电子显微镜(TEM)显微照片对细菌失活提出了不同的解释:他们观察到臭氧处理后大肠杆菌的类核收缩。这些作者得出结论，O3能够穿透细胞，并与细胞中的蛋白质或许多酶发生反应，这些酶参与控制DNA con的形成，从而导致其错误折叠。

细菌孢子

研究细菌孢子的主要兴趣在于它们是耐药的微生物，正因为如此，官方要求验证灭菌过程。细菌孢子可以经受严酷的处理，包括热、辐照、化学药品和干燥。芽孢杆菌种类的细菌孢子已被证明对臭氧特别敏感 (Kowalski et al.， 1998)，因此被用于本研究。人们先验地认为，细菌材料孢子受臭氧的影响比营养细菌小，因为它们具有多层保护和抗逆性。文献中已经提出了诱导孢子致死的各种O3靶点，下面我们将详细介绍。

酶

一些作者认为酶损伤是O3杀死细胞的重要失活机制(Hinze et al.， 1987;Takamoto et al.， 1992)。Young和Setlow(2004)表明，与野生型孢子相比，缺乏某种酶(第二皮层裂解酶(SleB))的萎缩芽孢杆菌突变孢子被O3灭活的速度更快(Khadre和Yousef, 2001;Young and Setlow, 2004)。此外，Takamoto等人(1992)观察到，臭氧在不同程度上降低了大肠杆菌中酶的活性，这取决于所考虑的酶的具体性质。

DNA。它也可能是一个靶标，因为O3与核碱基反应迅速，尤其是胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶(Ishizaki et al .， 1986;Swadeshi et al.， 1986)。相反，像Young和Setlow(2004)这样的作者声称水中的臭氧不会通过DNA损伤杀死孢子。在这里，水中的O3在100% RH的环境中被同化为臭氧。孢子的外套。孢子被毛是指，从孢子很外层开始，表层，然后是外被毛和内被毛。再往里看，有皮层，内膜和包含DNA的核心。孢子外壳约占孢子体积的50%，包含约80%的孢子蛋白质，因此构成代谢功能损伤的屏障(例如酶)。

孢子对杀菌剂产生抗性的主要因素似乎是孢子的外壳(Komanapali和Lau, 1996;Young and Setlow, 2004)。Kim等人(2003)的TEM显微照片也支持了这一观点，在水氧化处理的情况下，TEM显微照片显示了对表层以及外层和内层的损害。这种损伤为O3在皮层上的作用开辟了道路，很终通过细胞内损伤导致孢子失活(Kim et al.， 2003;Young and Setlow, 2004)。

此外，Foegeding(1985)发现，蜡样芽孢杆菌的外壳蛋白被去除后，在水溶液中比完整的孢子更快地失活:他们得出结论，孢子的外壳是对抗O3分子的主要保护屏障。更广泛地说，化学脱去的孢子和外壳有缺陷的孢子(结果来自主要外壳形成蛋白cotE的突变)被水溶液O3杀死的速度要比外壳完整的孢子快得多(Young和Setlow, 2004)。这使得Young和Setlow(2004)得出结论，孢子外壳(特别是在萎缩芽孢杆菌孢子中)在孢子对O3的抗性中是必不可少的。膜也会被氧化剂破坏，包括O3 (Cortezzo et al.， 2004)。很近的研究结果表明，孢子内膜可能是O3致死性损伤的部位，因为受损的内膜:

(i)阻止孢子在正常模式高温热处理或其萌发形式面临渗透胁迫时保持完整性;

(ii)因为它变得更具有渗透性。Cortezzo等人(2004)进一步研究发现，氧化剂对孢子内膜的破坏也与观察到的甲胺更快地渗透到处理过的孢子核心一致:内膜可能是甲胺进入孢子核心的关键渗透性屏障。这一渗透性屏障的破裂可能导致孢子核心内容物的释放(Khadre和Yousef, 2001;Young and Setlow, 2004)。

为了深入了解臭氧暴露后微生物的失活机制，我们首先使用干燥的气态臭氧，这是一个比潮湿的气态臭氧更不复杂的化学环境:

在气态臭氧中加入水蒸气会带来额外的氧化剂，使确定它们的相对贡献和确定失活机制变得更加困难。本文通过存活曲线研究了细菌孢子在严格干燥臭氧条件下的inac活化动力学，并利用扫描电镜 (SEM)检查了相应的损伤。还介绍了暴露于加湿臭氧的孢子的这种特征数据。利用文献资料，对这两组实验结果(干臭氧和湿臭氧情况)进行密切的“不同”分析，使我们能够提出一幅新的更详细的图片，说明细菌孢子在臭氧作用下的失活机制。

材料与方法

由于臭氧具有很强的氧化能力，它能或多或少地破坏各种材料。为了尽量减少这种可能的影响，这可能会干扰我们的实验，灭菌室由316不锈钢制成(要求承受加湿臭氧)，用于光谱观察的窗户由熔融二氧化硅制成。待调查的微生物沉积在由聚苯乙烯(干臭氧暴露)或耐热玻璃(湿臭氧暴露)制成的培养皿上。

臭氧化系统

图1显示了用于产生臭氧并在臭氧进入和离开腔室时测定其浓度的系统的各种元件。

该腔室由316不锈钢制成，是一个400毫米长，100毫米高，220毫米宽的平行六面体(6升体积)。

臭氧浓度可以用基于紫外线吸收的分析仪来监测。

生成的废水也可以通过FTIR光谱进行分析:来自Thermo Nicolet的Avatar 370光谱仪使用DTGS (7800-375 cm-1)探测器，扫描次数和分辨率分别设置为80和1 cm-1。

臭氧发生器在气相中提供分子氧和原子氧的混合物;

它在电流范围内工作，在电流范围内增加臭氧浓度。

臭氧流是干燥的，因为发生器是由(高纯度)O2干气瓶提供的。

本文所用的“干臭氧”一词是指相对湿度(RH)小于约2%(用湿度计测定)的气态臭氧。

总气体流量设定为5.64标准升/分钟(slm)，在干燥条件下实现臭氧浓度为4,000 ppm。

在工艺线的末端安装了一个臭氧破坏者，用于减少臭氧并将其作为O2释放，以符合安全(毒性)法规。

出于安全考虑，该腔室也位于通风柜内，并连接了真空干泵，以确保在过程结束时腔室流出物被完全排出。

在使用加湿臭氧的过程中可以加入水蒸气。

水通过蠕动泵送到“烤箱”(加热器)，产生的蒸汽被进入的O2气流驱动到O3管线。

在给定的加热器温度和给定的O2流量下，注入的水蒸气量取决于蠕动泵设定的H2O流量。

在单独存在O2的情况下，用湿度计(Kahn, Wethersfield, CT, USA)测定腔内相应的RH水平(RH可精确测量至少95%(0.3%))。

在加湿条件下，总气体流量设置为2.6 slm，以实现约4 000 ppm的臭氧浓度。

腔内气体温度保持接近环境温度(≈22℃)。

总结与结语

了解暴露于加湿气体臭氧导致的微生物失活机制是一项复杂而艰巨的任务。我们的方法是，在严格的干燥气体臭氧暴露(RH, 2%)下，检查三种生物指示孢子和一种细菌的失活动力学和形态损伤，然后考虑湿化气体臭氧暴露的情况:很后，将这两项研究的结果相关联，有助于揭示各种失活机制。

在干燥的气态臭氧暴露下，我们已经证明O3分子可以有效地灭活某些类型的孢子(G. stearothermophilus)，而其他类型的孢子(B. atrophaeus)则更少，灭活率的差异可能在于其成分的性质或排列，本质上是其外壳(和内膜)的化学成分。孢子的形态不受干臭氧处理的影响，这意味着扩散/氧化，而不是侵蚀，与O3分子的作用有关，这些分子在孢子内移动。

此外，我们还表明，沉积在不同聚合物基质上的孢子的臭氧灭活效果取决于聚合物的性质。

在加湿的气态臭氧暴露下，我们认为一个重要的初始机制(在杀生物作用之前)是孢子的水膨胀，这打开了“通道”，促进了杀生物剂的内部扩散。

这些是O3分子及其与H2O相互作用的副产物，产生高度氧化的物质，如HO.2, OH。过氧化氢。这些氧化过程的很终结果是在一定程度上抵抗干臭氧作用的孢子(b.s atrophaeus)失活，在足够长的暴露时间后，这里使用的所有三种生物指示剂都被严重破坏，甚至粉碎。O3分子和氧化自由基对湿化臭氧失活过程的相对贡献可以在未来的工作中确定。下一步可能是呼吁分子生物学来评估孢子核酸所遭受的损害的种类和程度。

正在进行涉及臭氧和表面净化的进一步工作。它涉及的事实是，通过将某些聚合物置于干燥的臭氧流(通常为4000 ppm 1小时)中，可以赋予其生物杀灭性能。然后，当在这些处理过的表面上沉积细菌孢子时，同一天或2-3天后，并让它们干燥24小时，观察到初始种群减少3到5对数(Mahfoudh等人，2010;Mahfoudh et al.， 2010)。